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PCR技巧道理、试验步调和应用

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  PCR,又称聚合酶链式反应,基起源基础理相似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依附于与靶序列两头互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延长三个基本反应步调构成。本文具体整顿了 PCR 试验道理、试验步调、引物设计、结果剖析,和各类 PCR (RT-PCR、Realtime-PCR、QPCR)的差别、试验方法和罕见后果汇总。

  1、试验目标

  1.控制聚合酶链式反应的道理。

  2. 控制移液枪和PCR仪的基本操作技巧。

  2、试验道理

  PCR技巧,即聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年(1993年获诺贝尔化学奖)建立的。这项技巧可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍,这类敏捷获得少量单一核酸片段的技巧在分子生物学研究中具有没有足轻重的意义,极大年夜地推动了生命迷信的研究停顿。它不只是DNA剖析最经常使用的技巧,而且在DNA重组与表达、基因结构剖析和功用检测中具有主要的应用价值。

  PCR可以被认为是与爆发在细胞内的DNA复制过程相似的技巧,其结果都是以本来的DNA为模板发生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个十分复杂的过程。参与复制的有多种要素。PCR是在试管中停止的DNA复制反应,基起源基础理与细胞内DNA复制相似,但反应系统相对较复杂。

  PCR由变性--退火--延长三个基本反应步调构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃摆布一按时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增构成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物联合,为下轮反应做准备;

  ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃摆布,引物与模板DNA单链的互补序列配对联合;

  ③引物的延长:DNA模板--引物联合物在Taq酶的感化下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保管复制道理,分化一条新的与模板DNA 链互补的半保管复制链。

  重复轮回变性--退火--延长三过程,便可取得更多的“半保管复制链”,而且这类新链又可成为下次轮回的模板。每完成一个轮回需2~4分钟, 2~3小时就可以将待扩目标基因扩增缩小几百万倍。

  3、试验试剂与器材

  模板DNA、2.5mmol/L dNTP

  Taq DNA聚合酶(5U/μL)、SSR引物

  10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

  PCR仪、移液枪、PCR板

  4、试验步调

  1、配制20μL反应系统,在PCR板中依次参与以下溶液:

  模板DNA 2μL

  引物1 1μL

  引物2 1μL

  dNTP 1.5μL

  MgCl2 2μL

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